A、构建基因表达载体时，一般用相同的限制酶处理含有目的基因的片段和质粒，以产生相同的黏性末端，因此也可以用能产生相同黏性末端的不同限制酶处理，A错误；
B、DNA连接酶能在两个相同粘性末端配对后的磷酸与脱氧核糖之间形成化学键（磷酸二酯键），B正确；
C、大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对胰岛素原进行加工，因此人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原没有生物活性，C错误；
D、人体胰岛细胞在合成胰岛素原时，转录在细胞核中进行，翻译在细胞质的核糖体上进行，D错误．
故选：B．
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