首先根据化合物的类别与分离要求确定合适的柱子和流动相，然后是考虑流动相里是否加入缓冲液，接着是柱温、流速、梯度、检测器参数（这些参数相互掣肘，需要综合考虑），最后在根据实际谱图考虑梯度的优化。
这得看你的情况，你分离的话化合物。
手性化合物首先考虑柱子（这也算是色谱条件）；
其它极性相近化合物首先考虑流动相配比及梯度，然后是流动相种类，加不加缓冲盐等，最后还可以衍生化产物再做检测，这个最麻烦，只能作为研究用。
建议查阅类似混合物的分离条件的相关文献！
可以先做一些简单的尝试，比如温度、梯度比例；
其次是流动相配方、色谱柱长度、填料等
您具体分离 或者说是分析什么物质，请详细
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