（Bradford法）如何测定蛋白浓度？

考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度
1、试剂：

（1）考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

（2）标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。

2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器

3、标准曲线的制作
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
4、样品中蛋白质含量的测定

另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
注意事项：
1、 如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光 吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。

2、 若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。