晕，怎么相差这么大，实在没办法的只能这么设计的话，可以增加延伸时间了，你的下游完全没必要退火了，或者68度延伸，做两步扩增延伸是这温度。
重新设计下引物吧，上下游TM没有差这么多的，一般差8℃就算比较大的了，退火温度都很难摸索，你这一下差了18℃，实在没办法，不过你可以尝试下Touch down。
