葡萄糖标准曲线的测定方法有哪些

一：松茸菌的培养及菌丝体的前处理：
1. 培养基的配置：
培养基配方：土豆2000克，葡萄糖200克，磷酸二氢钾30克，七水硫酸镁30克，
维生素B1500到1000mg。
配制方法：称取2000克土豆，加水10L，加热煮沸，沸腾20分钟，用煮出来的汁液将上述药品溶解，若不到10L，用蒸馏水补加至10L。 2. 发酵罐培养：
将配好的培养基放入发酵罐，灭菌，然后接种松茸菌体，培养3至5天。 3. 菌丝体的处理：
将发酵液取出，5500rpm，离心10分钟，弃上清，取沉淀（菌体），放入平皿内铺平，
冻干，然后用万能粉碎机粉碎，过60目筛，装入自封袋内，放到干燥期内保存，待用。
二．多糖的提取及分离纯化：
1. 超声波处理：
取10克粉碎的松茸菌体，加水700mL（液料比70：1），混匀至没有颗粒，用超声波细胞粉碎机在400W下处理210秒。（经实验验证此条件下多糖的提取率最高）。 2. 粗提：
（1）离心：将悬浊液在10000rpm离心10分钟，取上清，弃沉淀。
（2）除杂质、去色素、去离子：浓缩液加2倍体积三氟三氯乙烷，5~C高速搅动振荡，取上层多糖溶液，反复3次，Sevag法除蛋白质(正丁醇：氯仿：4：1，5~C高速搅动振荡，取下层多糖溶液)，反复4次。多糖溶液加等量活性碳，煮沸10～20min，抽滤，留滤液。溶液装入透析袋，透析24h。 （3）沉淀与干燥：多糖溶液加95％乙醇．至溶液乙
醇含量75％．7000r／min离心15min，倒去上清夜，将沉淀物真空干燥，得粗多糖。 3. 纯化：
（1）装柱、平衡：15g Sephadex G一75置d=3cm层析柱，0．1mol／L的NaCl溶液平衡。
（2）上样、收集、测试、合并：洗脱液流速0．8mL／min，样品溶解成3mL体积，过柱；部分收集器收集洗脱液50管，每管3mL：定量取各管收集液0．2mL，蒽酮硫酸法测含量．分光光度计620nm处测0D值，合并多糖含量最高的几管洗脱液。
（3）醇析与干燥：洗脱液浓缩，加无水乙醇，调节溶液乙醇浓度为75％，7000r／min离心15min，取沉淀，真空干燥。 4. 蒽酮硫酸法测多糖的具体步骤： （1）标准曲线的制作：
2g/L蒽酮试剂：溶解2g蒽酮于浓硫酸（A.R.95.5%）中，当日配制使用。

0.1g/L葡萄糖溶液：准确称取标准葡萄糖0.01g，用少量蒸馏水溶解后定容至100mL容量瓶中。
分别取0.1g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，用蒸馏水补到1.00mL；分别加入4.00mL蒽酮试剂，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10分钟取出，用自来水冷却，室温放置10分钟左右，于620nm比色。以同样处理的重蒸馏水为空白，进行比色。以光密度为纵坐标，糖的含量微克数为横坐标，得标准曲线。
(2)样品中的多糖的测定：
将样品稀释50倍，取出1mL加入4mL蒽酮试剂，迅速浸于冰水浴中冷却，浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10分钟取出，用自来水冷却，室温放置10分钟左右，于620nm比色。以同样处理的重蒸馏水为空白，进行比色。在标准曲线上找到光密度值所对应的糖浓度。 5. 提取率及纯度测定：
（1）提取率的计算：用测得的多糖质量除以10克，即为多糖的提取率。
（2）：精确称量CMPS2mg，加蒸馏水25mL配成多糖溶液，同前法操作，测定其在波长620nm的0D值，将结果代人标准曲线中，求出CMPS的糖含量。

试剂：2g/L蒽酮试剂：溶解2g蒽酮于浓硫酸中，现配使用。 0.1g/L葡萄糖溶液 操作：
1. 制标准曲线：分别取0.1 g/L葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0、60、0.80ML，用纯水补到1.00ML，分别加入4.00ML蒽酮试剂，迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，封口防蒸发，准确煮沸10分钟，取出用自来水冷却，室温放置10分钟，于620nm处比色。以同样处理的纯水为空白进行比色，以光密度为纵坐标，糖含量微克数为横坐标，得标准曲线（R2＞0.995）
2. 测样品含量：取糖浓度50ug/ml左右的样品溶液1.00ML，加入蒽酮试剂，同标准曲线制作之操作，比色测定。根据标准曲线和样品浓度计算含量。