组织培养的方法和程序有哪些？

1.外植体的建立

（1）外植体的选取 组织培养的外植体，一般分为两类：一类是带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等，在组织培养过程中可直接诱导促进丛生芽的大量产生，其获得再生植株的成功率较高，变异性也较小，易于保持材料的优良性状。另一类主要为根、叶等营养器官及花药、花瓣、花托、胚珠、果实等生殖器官。这类外植体大都需要一个脱分化过程，经过愈伤组织阶段再分化出芽或产生胚状体然后形成再生植株。

在快速繁殖上，最常用的外植体是茎尖。通常切块在0.5厘米左右，太小，产生愈伤组织的能力较弱；太大，则在培养器皿中占空间太多。如果为培养无病毒苗而采用的外植体，通常仅取茎尖分生组织部分，其长度常在0.1毫米以下。

（2）外植体的消毒 由于外植体大都采用外界生长的植株，常带有各种微生物，如带入培养基，会迅速繁殖而形成污染，导致培养工作的失败。因此，外植体消毒是必不可少的工作，消毒既要杀灭外植体上的病菌，又不能伤害材料而影响其生长。由于材料不同，栽培条件、季节等不同，不同外植体消毒应选用各自合适的消毒剂种类、消毒剂浓度、消毒时间及处理程序。

理想的消毒剂应有较强的杀菌能力，并应具有易去除而不易伤害外植体的特点。常用的有次氯酸钠（0.5%～10%）和漂白粉（1%～10%）滤液，能分解产生具杀菌作用的氯气，并自行散发到空气中，只要浓度得当，一般不会伤害外植体。双氧水（3%～10%）也易分解而不易伤害外植体。酒精（70%）具较强的渗透力和杀菌作用，且易挥发，但会杀死组织细胞，所以消毒时间不宜过长。常用酒精先消毒几秒钟，有利其他消毒剂渗入材料发挥杀菌作用。

消毒方法和程序因材料不同而异。通常先用酒精（70%）浸数秒，取出后置于10%次氯酸钙饱和上清液浸10～20分钟或2%～10%次氯酸钠溶液浸6～15分钟，取出后用无菌水冲洗3次。

2.外植体的增殖

外植体的增殖是组培的关键阶段。接种后的培养容器在培养室中，一般每天光照16小时，1500～3000勒克斯，温度在25℃左右进行分化培养。在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，还需要进行继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖培养1个月左右后，可视情况进行再增殖，经一次又一次的继代，即可增加植株数量。

继代培养中由于外植体本身来自无菌环境，不需要消毒，操作较方便。但由于继代培养中外植体分化能力会逐渐下降，所以继代培养代数也不是无止境的。

3.根的诱导

继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转移到生根培养基上进行生根培养。生根培养基较多用1/2MS培养基，因为降低无机盐浓度有利于根分化。此外，生根培养基在激素种类和浓度上与增殖培养基有较大差异，主要如细胞分裂素、生长素等，一般细胞分裂素抑制生根而生长素促进生根。

一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得健壮根系。此外，生产中也有用具根原基试管苗，即只在生根培养基中培养7～10天，诱导根原基或小于1毫米的幼根后即用于移植。由于其基部切口已愈合而形成根原基，不易感染，且栽后能很快生根，具较高的成活率。

4.组培苗的炼苗移栽

生根或形成根原基的试管苗从无菌，光、温、湿稳定环境中进入自然环境，从异养过渡到自养过程，必须经过一个驯化锻炼过程，即所谓炼苗。

一般移植前，先将培养容器打开盖子，于室内自然光照下放3天，然后取出苗，用自来水将根系上琼脂冲洗干净，再栽入已准备好的基质中。基质常用泥炭、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等或适当加部分园土，使用前最好用高温或药物消毒。移栽前期要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度90%左右）。但注意基质不宜过湿，更不能积水，以防烂苗。此外，温度对成活率影响也很大，以15～25℃最适宜，夏季温度过高，水少小苗易萎蔫，水多又易腐烂，管理较困难，成活率下降。炼苗4～6周，新梢开始生长后，小苗即可转入正常管理。