DNA聚合酶的举例

大肠杆菌DNA聚合酶
1、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ）这是1956年由ArthurKornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。
⑴理化性质：纯化的DNApolⅠ由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。分子含有一个二硫键和一个-SH基。通过二个酶分子上的-SH基与Hg2+结合产生二聚体，仍有活性。每个酶分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子每分钟在37℃下能催化667个核苷酸掺入正在生长的DNA链。经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为Klenow片段，小片段的分子量为34KD。此酶的模板专一性和底物专一性均较差，它可以用人工合成的RNA作为模板，也可以用核苷酸为底物。在无模板和引物时还可以从头合成同聚物或异聚物。
DNAPolⅠ在空间结构上近似球体，直径约65A。在酶的纵轴上有一个约20A的深沟（cleft），带有正电荷，这是该酶的活性中心位置，在此位置上至少有6个结合位点：
[1]模板DNA结合位点；
[2]DNA生长链或引物结合位点；
[3]引物末端结合位点，用以专一引物或DNA生长链的3'-OH;
[4]脱氧核苷三磷酸结合位点；
[5]5'→3'外切酶活性位点，用以结合生长链前雹碧渗方的5'-端脱氧核苷酸并切除之；
[6]3'→5'外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的3'-端核苷酸。
2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ（DNApolⅡ）：DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突变株仍能生存，这表明DNApolⅠ不是DNA复制的主要聚合酶。人们开始寻找另外的DNA聚合酶，并于1970年发现了DNApolⅡ。此酶MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。该酶的催化特性如下：
⑴聚合作用：该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA而中间有空隙（gap）的单链DNA部分，而且该单链空隙部分不长于100个核苷酸。对于较长的单链DNA模板区该酶的聚合活性很低。但是用单链结合蛋白（SSBP）可以提高其聚合速率，可达原来的50-100倍。
⑵该酶也具有3'→5'外切酶活性，但无5'→3'外切酶活性。
⑶该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2-脱氧核苷酸掺入到DNA链中。
⑷该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。
3、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ（DNApolⅢ）：DNA pol Ⅲ全酶由多种亚基组成(见下表），而且容易分解。大肠杆菌每个细胞中只有10-20个酶分子，因此不易获得纯品，为研究该酶的各种性质和功能带来了许多困难。直到不久前，才对其性质和功能有所了解，但每个亚基的具体作用扔不十分清楚。尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶Ⅱ的15倍和30倍。该酶对模板的要求与DNA聚合酶Ⅱ相同，最适模板也是链DNA中间有空隙的单链DNA，单链结合蛋白可以提高该酶催化单链DNA模板的DNA聚合作用。DNApolⅢ也有3'→5'和5'→3'外切酶活性，但是3'→5'外切酶活性的最适底物是单链是DNA，只产源脊生5'-单核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从3'端开始切除一个核苷酸。5'→3'外切酶活性也要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。DNA聚合酶Ⅲ是细胞内DNA复制所必需的酶，缺乏该酶的温度突变株在限制温度（non permissive temperature）内是不能生长的，此种突变株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶Ⅲ则可以恢复其合成DNA的能力。
DNA聚合酶Ⅲ的组成
亚基 分子量（×103) 其它名称
a 140 dnaE蛋白，polC蛋白
ε 25
θ 10
τ 83
γ 52 dnaZ蛋白
δ 32 dnaX蛋白
β 40 dnaN蛋白，copolⅢ
大肠杆菌三种DNA聚合酶的特性 功能polⅠpolⅡpolⅢ聚合作用5'→3'　　+++外切酶活性3'→5'慧团+++焦磷酸解和焦磷酸交换作用+-+模板及引物的选择　　完整的DNA双链---带引物的长单链DNA+--带缺口的双链DNA+--双链而有间障的DNA+++外切酶活性5'→3'+-+　　一般性质
分子量 1 09KD 120KD >140KD
每细胞中的分子量
结构基因 polA polB polC
T4-DNA聚合酶
最近年来在枯草杆菌，鼠伤寒沙门氏杆菌等细胞及噬菌体T4、T5、T7中分离到DNA聚合酶，这里只介绍T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ相似，也是一条多肽链，分子量亦相近，但氨基酸组成不同，它至少含有15个半胱氨酸残基。但是，它在作用上与大肠杆菌DNApol不同；[1]它无5'→3'外切酶活性；[2]它需要一条有引物的单链DNA作模板。在有缺口的双链DNA作模板时，需要有基因32蛋白的辅助（基因32蛋白在T4DNA复制中的作用和大肠杆菌单链结合蛋白的作用相似，基因32蛋白在复制叉处和单链DNA结合后可以促进双链的进一步打开，并保持其单链状态有利于新生链的合成）；它利用单链DNA为模板进，可同时利用它作为引物，即此单链DNA的3'端能环绕其本身的某一顺序形成氢键配对，3'端的未杂交部分即被T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性切去，然后在其作用下从3'-OH端开始聚合，合成该模板DNA的互补链，再以互补链为模板合成原来的单链DNA。
真核生物的DNA聚合酶
真核生物的DNA聚合酶：真核生物中也具有几种DNA聚合酶，但这些聚合酶都没有3'→5'或5'→3'外切酶活性。其聚合反应机制与原核生物的聚合一样。主要的酶（占总量的80-90%）是DNA聚合酶α，分子量为300KD，含有4个或5个亚基，主要负责染色体DNA的复制。DNA聚合酶β，分子量为45KD，仅含有一条链，主要作用是修复核内DNA。第三种聚合酶γ，分子量为140KD，存在于线粒体内，负责催化线粒体DNA的复制。最近从兔的骨髓细胞质中分离到一种新的DNA聚合酶，这种酶与上述真核生物的DNA聚合酶不同，而与原核生物的聚合酶类似，具有3'→5'核酸外切酶活性，称为DNA聚合酶δ。另外，从酵母、原虫等低真核生物中分离到一些DNA聚合酶。一般来说，这些低等生物都没有低分子量的DNA聚合酶β，而且与原核生物的DNA聚合酶相似，有3'→5'外切酶活性。
实验室常用的耐热DNA聚合酶
耐热DNA聚合酶多应用在PCR技术中。各种耐热DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除错配，切平末端；5'-3'外切酶活性可以消除合成障碍。由于上述这些不同，可以将耐热DNA聚合酶分为三类：
一、普通耐热DNA聚合酶
Taq DNA 聚合酶
由一种水生栖热菌yT1株分离提取出，是发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种，达200,000单位/mg。具有5'-3'外切酶活性，但不具有3'-5'外切酶活性，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。
TaqDNA聚合酶还要具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链3'加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3'突出的单A核苷酸尾；另一方面，在仅有dTTP存在时，它可将平端的质粒的3'端加入单T核苷酸尾，产生3'端突出的单T核苷酸尾。应用这一特性，可实现PCR产物的T-A克隆法。
Tth DNA 聚合酶
从Thermus thermophilus HB8中提取而得，该酶在高温和MnCl2条件下，能有效地逆转录RNA；当加入Mg2+后，该酶的聚合活性大大增加，从而使cDNA合成与扩增可用一种酶催化。
二、高保真DNA聚合酶
pfu DNA 聚合酶
是从Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶，它不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低。PCR产物为平端，无3'端突出的单A核苷酸。
Vent DNA 聚合酶
该酶是从Litoralis栖热球菌中分离出的，不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可以去除错配的碱基，具有校对功能。
三、DNA序列测定中应用的耐热DNA聚合酶
Promega公司测序级TaqDNA聚合酶
是在TaqDNA聚合酶的基础上对它进行修饰，去除5'-3'外切酶活性，保证测序记过的高度准确性，可产生强度均一的测序条带，背景清晰。
Bca Best DNA 聚合酶
从Bacillus Caldotenax YT-G菌株中提纯，并使其5'-3'外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的伸长性能优越；可抑制DNA二级结构形成，可以得到均一的DNA测序带。
Sac DNA 聚合酶
从酸热浴流化裂片菌中分离，无3'-5'外切酶活性，可用于DNA测序，但测序反应中ddNTP/dNTP的比率要高。