木霉生物反应器

如上所述，木霉菌株可用于表达生产纤维素酶类、疏水蛋白等，它的活细胞俨然是现代工业发酵生产线上不可缺少的“生物机器”，还可以作为生物反应器生产异源蛋白（Adrio et al.，2003）。

包含木霉在内的丝状真菌表达系统是近年来新兴的用于外源基因表达的体系，它可以克服在原核表达系统中无法进行特定翻译后修饰的缺陷，而且比酿酒酵母具有更高的分泌外源蛋白的能力，所以成为生产具有生物活性的真核生物蛋白的重要体系。我们可以通过增加基因拷贝数或对酶分子的结构进行改造来增加突变效率，而可以得到高产的工业菌株。

木霉的转化系统与其他真菌转化系统相似，多为使用细菌来源的质粒构建的载体，在聚乙二醇（PEG）、山梨醇和氯化钙作用下把目的基因或DNA片段引入受体原生质体，经过再生和选择获得转化子。1998年，De Groot等首次利用ATMT法对6种丝状真菌（包括T.reesei）进行了转化，并获得了成功。

最早作为生物反应器生产异源蛋白的木霉是T.reese，20年前它用来表达犊牛凝乳酶（Uusitalo et al.，1991），随后用来表达免疫活性抗体片段（Nyyssonen et al.，1993）。

T.reesei是纤维素酶、半纤维素酶的主要工业生产菌株，该菌无毒无害，具有强大的蛋白分泌能力，某些突变株的外分泌蛋白量可达100g/L，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此是一种非常理想的重组蛋白表达宿主，受到国际著名酶制剂公司（如Genencor、Novozymes等）的高度重视，并成功应用于多种酶制剂表达和生产。

T.reesei中纤维二糖水解酶 CBH1 由单拷贝基因编码，其分泌量占外分泌蛋白的64%～80%，因此，CBH1的启动子通常被用作强启动子表达异源蛋白。Joutsjoki于1993年构建了两种载体，一种含有Hormoconis resinae葡萄糖淀粉酶P的基因（gamP），另一种含有相应的 cDNA，都在 T.reesei的 cbh1 启动子控制下表达，这些载体经转化后置换T.reesei的cbh1基因。在这两种载体中，cbh1启动子都精确地连接到gamP蛋白质编码区上游，指导T.reesei分泌出有活力的葡萄糖淀粉酶P（GAMP）。研究结果表明，含有gamP cD-NA的最优转化体能分泌大约700mg/L有活力的GAMP，是在H.resinae中产量的20倍。

董欣睿等（2012）利用cbh1强启动子成功异源表达了来源于糙皮侧耳（P.ostreatus）的漆酶基因，结果表明通过摇瓶发酵得到的粗酶液的酶活为237.134IU/mL，是目前国内外文献报道最高的，其发酵周期为144 h，酶活较其出发菌P.ostreatus提高了近30倍，且远高于真菌漆酶在黑曲霉（Aspergillus niger）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和米曲霉（Aspergillus oryzae）中异源表达的最高表达量。

汪天虹等（2003）采用PCR技术获得了T.reesei的cbh1的启动子和终止子序列，并以大肠杆菌质粒 pUC19 为骨架，在该启动子和终止子序列间加入多克隆位点，构建了T.reesei强表达整合型载体pTRIL，为以T.rseesei作为宿主菌生产真核生物同源或异源蛋白提供了条件。在此基础上的深入研究，很有希望将T.reesei表达系统发展成为一种新型真核生物表达系统用以大量表达人类所需的各种蛋白质，为真核基因产物的生产提供又一条可选择的途径。

利用丝状真菌作为宿主菌生产重组蛋白时，降低宿主的主要蛋白酶产量可以减少对外源蛋白的降解，最终提高外源目的蛋白的得率。实践表明，用传统的诱变方法或基因敲除的方法，使主要蛋白酶基因失活是避免重组蛋白降解的主要手段。Mattern等（1992）用所得到的Apergillus niger蛋白酶缺失突变株作为宿主表达胞外异源蛋白酶，使突变株外源蛋白分泌量有大幅度提高。汪天虹等（2004）将解除了葡萄糖阻遏的纤维素酶高产菌株T.reesei Rut C30通过化学诱变的方法得到了蛋白酶部分缺陷突变株T.reesei Rut C30M3，突变菌株Rut C30M3的胞外蛋白酶活力比亲本株降低约74%，但生长特性、产纤维素酶活力等性状与亲本相同，有利于将其作为强表达体系中的宿主菌提高外源蛋白的产量，用于大量生产同源与异源蛋白。

结语

木霉（Trichoderma spp.）是一类具有很大应用生产潜力的真菌，木霉属真菌的生物降解及生物转化功能与分泌纤维素酶、葡聚糖酶、几丁质酶、脂肪酶、木聚糖酶等酶的能力相关。己知多种木霉，如T.harzianum，T.aureoviride，T.atroviride，T.koningi，T.longibrachiatum，T.viride，T.pseudokoningii，T.hamatum 及 T.reesei等均能产生多种酶系；而且研究发现木霉在厌氧条件下可以直接将纤维素或糖发酵成酒精，其菌丝中含有大量的油脂颗粒，在生物能源方面显示出巨大的应用前景；木霉能够用来生产纳米级的金属颗粒；木霉分泌蛋白的能力强，是良好的异源蛋白生物反应器等。总之，木霉与工业生物制造有千丝万缕的联系，是重要的工业生物种类之一。

目前，木霉最为广泛的应用是生物防治，大量的实验证明对土传病菌有良好抑菌效果，并已制成生物制剂投放市场。没有资料表明木霉是人类的病原体，Hjortkjaer等（1986）用老鼠、豚鼠和兔子进行T.reesei致病性研究，得到的数据表明T.reesei并不具有致病性；Nevalainen等（1994）表明T.reesei不仅是安全的酶制剂生产菌株，而且作为异源蛋白表达宿主菌也是安全的；夏润玺等（2012）利用家蚕作为研究对象，研究了T.viride作为生防菌的毒性，结果表明，木霉菌T23对家蚕生长发育、生命力及茧质等均无显著影响。以上安全性试验为木霉在实际生产中的应用奠定了基础。

随着科学家对木霉基因组数据的分析，对各种外泌蛋白等合成过程所涉及的基因及其调控因子的调控模式进行探索，必将推动木霉在生物制造领域的更广泛应用。