酸性橙Ⅱ的检测方法

据中国国内文献报道，酸性橙II的测定方法有纸层析法和分光光度法等，这些方法操作时间长，定量精度差。经过大量实验摸索，建立了高效液相色谱（HPLC）法测定食品中酸性橙Ⅱ的方法，本方法快速、准确，适用于食品中合成食用色素与非食用色素酸性橙II的同时测定。
原理：食品中非食用色素酸性橙Ⅱ经提取制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性，采用外标法进行定量。
仪器：高效液相色谱仪:Waters515泵，Waters紫外可见波长检测器，KQ-100DB型数控超声波清洗器，离心机。
试剂：重蒸馏水、乙酸、甲醇（色谱纯）、聚酰胺粉（过200目筛）、乙酸铵溶液（0.02mol/L）、柠檬酸溶液、无水乙醇-氨水-水溶液。酸性橙Ⅱ:美国Aldrich公司;柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄:国家标准物质中心。
酸性橙Ⅱ标准溶液：准确称取干燥的酸性橙标样0.1000g，蒸馏水溶解，定容至100ml，此溶液1ml含1.00mg酸性橙Ⅱ。临用时，用蒸馏水稀释至1ml含10mg的酸性橙Ⅱ标准使用液。混合着色剂标准溶液:准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、酸性橙Ⅱ各0.100g，置100ml容量瓶中，加pH6水到刻度，配成水溶液（1.00mg/ml），临用时，用水稀释经0.45μm滤膜过滤，配成每毫升含各种标准物质10μg的混合着色剂标准使用液。
高效液相色谱参考条件
色谱柱：Diamonsil TM （钻石）C 18 5μm，200mm4.6mm色谱柱（迪马公司产品）；
流动相：甲醇（A）：0.02mol/L醋酸铵（B）；
流速：1.0ml/min，梯度洗脱如表1所示；
进样量：20μl；
柱温：室温；
紫外可变波长检测器：λ=484nm。
试样制备及测定
结果判断示意图液体样品：饮料实验前，对于含二氧化碳试样应预先加热驱除二氧化碳；配制酒类加热驱逐乙醇，可不经稀释，过0.45μm滤膜后测定。
固体样品：糕点类、卤制品类、灌制品类、辣椒面等样品，称样5.00～10.00g，粉碎混匀，加无水乙醇-氨水-水（70+1+29）溶液20ml，振摇0.5h，过滤，洗滤渣2次，合并滤液，用水（pH=6）定容，过0.45μm滤膜测定。
奶制品：可称量5.00g试样，按GB5009.23-2003聚酰胺吸附法提取色素，经0.45μm滤膜过滤测定。
色谱条件对测定的影响：酸性橙II在波长484nm测定，样品中常见的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、咖啡因、维生素C、乙酸、柠檬酸等（1mg/ml）在可见波长下无响应，不干扰测定。
流动相的选择：采用甲醇+醋酸铵体系作流动相，试剂价格便宜、易得，采用梯度洗脱可以同时测定柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄。
线性范围：对酸性橙Ⅱ在0.00～200μg/ml的范围内配制标准溶液系列9点，每标样进3针，以标样的峰面积的平均值为纵坐标，以标样的浓度为横坐标，绘制标准曲线，并利用最小二阶乘法进行线性回归，得到在0.00～100μg/ml范围内的线性方程为:A=85339.63C+105139.37，相关系数r=0.9997，酸性橙Ⅱ的检出限为0.05μg。柠檬黄、苋菜红、胭脂红及日落黄在0.00～50μg/ml范围内的线性方程分别为:A=74329.36C+5351.26，相关系数r=0.9987;A=85428.98C+125212.42，相关系数r=0.9982;A=85268.23C+112145.94，相关系数r=0.990;A=929123.47C+152372.68，相关系数r=0.9972。
精密度：将酸性橙II试样（卤鸡爪）溶液应用本方法分别连续进样8次（n=8）。可以看出此方法精密度高，其变异系数为5.91%。
检出限：进样量10.0μl，酸性橙II的最小检出量为0.10μg，结果相对允许偏差<10%。