你设计的引物退火温度相差并不是太多的啊，我们一般将上下游引物退火温度平均值加2度作为退火温度，如果你不放心可以做个梯度PCR，一般可以筛选出相对较好的退火温度。如果还是没P出来可以用TouchDown PCR试试
