Overlap PCR开始几个循环模板本来就是当引物使用的，所以模板可以多加，1和2都加到100ng左右。
你没有告诉我1b(2a)的Tm，Overlap的前几个循环要考虑两个模板互补的Tm。你的退火温度太低了，特异性不够强（除非你的Taq酶对退火温度有特殊要求，这个我不知道）。
我的建议：前10个循环，用1a，1b，2b中最低的Tm做退火温度，适当延长退火时间。后25个循环用1a，2b中最低的Tm做退火温度，正常退火时间（和你Taq酶的要求有关）。你模板链长度不小，不要怕多加模板。
楼上说得很有道理。温度很低啊。
建议你先不要加引物，做10个循环（模板本身就是引物）。然后再加入引物1a和2b.
还有退火温度比TM低5度，40度那步不要。可以换成49度5个循环。
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