一抗是完整的蛋白，如果和样品混加在一起，在样品煮沸变性时会连一抗都解链成多肽，PAGE电泳后也会变成条带啦，完全失去作用了。
我倒是想过，如果我的一抗特异性非常好，能不能直接和蛋白样品孵育，再和二抗孵育，再加化学发光剂，然后取一定量的样品在酶标仪中进行分光光度测量，根据测量结果分析目的蛋白量得增减。不知道这样可不可以。不过这样一来好像就变成了复杂版得ELISA实验了。。。 。。。
在SDS-PAGE电泳前，一般样品加入上样缓冲液中并煮沸5~10分钟，让蛋白样品变性并带上一定电荷，使蛋白迁移速度只与分子量相关，这样才能将不同的蛋白通过电泳尽量的区分开来。这个过程中，会打断一些分子间的相互作用，包括抗体和蛋白样品间的相互作用，也许是没人这么做的原因。
那你的一抗也变性了，二抗无法识别它的空间表位
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