你在用DNAMAN的多序列比对时，在弹出的对话框中可能没有选择“尝试使用双链”吧？包括编码链和非编码连的比对，你测序得到的目的片段可能是非编码链（即你目的基因的编码链的互补序列），而NCBI中提交的序列都是编码链的序列。
你比的是核酸 还是氨基酸？？
NCBI比对跟DNAMAN比对是有区别的 NCBI是局部比对 DNAMAN是全序列比对
假如你的序列是A长1000bp， NCBI上搜索相似度99%的序列为B长5000bp
那NCBI上比对可能是B序列中100-300bp同A序列中某段比对相似，然后中间的缺失掉，3000-3500跟A序列中部分序列相似，所以最终相似度高
但是在DNAMAN中 直接把所有的B中5000个bp同A的1000bp比对 相似性肯定就低了
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