求助QIAGEN试剂盒提取总RNA的步骤

总RNA提取试剂盒步骤：

1.  样品处理：

    a. 植物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀。

   b. 动物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。

   c. 贴壁细胞：直接在培养板中加入裂解液裂解细胞，每106细胞加1ml 裂解液。用取样器吹打混匀。

   d. 细胞悬液：离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。

   e. 血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。

2. 将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3. 向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟。

4. 2-8℃ 12000 rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀。

5. 吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul 洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。

6. 第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2分钟，2-8℃ 12000rpm离心2min，弃废液。

7. 向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。

8. 向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。

9. 12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。

10. 将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即得到RNA。

植物材料 用最精确的方法，称取不超过100mg的植物材料，置于处理过的研钵，加入液氮进行研磨 将研磨得到的粉末，快速转移至无RNase，并经过液氮冷却的2mL离心管(自备)，注意材料要保持冷冻状态 加入450µL Buffer RLT（1mL 加入10μL β-巯基乙醇），颠倒混匀，涡旋 将溶解物转移至于淡紫色的QIAshredder spin column，最大转速离心2分钟，取上清转移至新的2mL的收集管（自备） 加0.5倍体积（约225μL）的无水乙醇，迅速吹打混匀 将样品(约650μL )转移至带有2mL回收管的粉色RNeasy spin column（以下简称column），>=8000g离心15s,将滤出物丢弃 加入700µL Buffer RW1至column，>=8000g离心15s清洗柱子上的滤膜,丢弃滤出物和收集管 转移column至新的收集管（提供），加入500 µL Buffer RPE，>=8000g离心15s清洗柱子上的滤膜,丢弃滤出物 再加入500µL Buffer RPE，>=8000g离心2分钟清洗柱子上的滤膜 (为了保证除净Buffer RPE，可弃旧的收集管和滤出物，取新收集管(自备) 最大转速离心1分钟) 转移RNeasy spin column至1.5mL收集管（提供），加入30-50µl 无RNA酶的水于滤膜上，>=8000g离心1分钟，洗脱RNA （如果预期得到的RNA大于20µg，可重复第十步） 或者看说明书最好了