请问分子生物学专家问题 RNA聚合酶二的转录因子它们的结合顺序是怎样用实验的方法证明的

3.2 酵母RNA聚合酶及转录复合物结构的描述
3.2.1 调节器的发现
包含纯化的RNA聚合酶II，5个通用转录因子TFIIB，E，F，H和TATA结合蛋白的体系只能维持基础转录，而对于基因特异性激活蛋白的转录则无能为力。对这一问题的研究导致了调节器的发现，并使真核转录的一些早期遗传数据得到很好的解释。调节器是由大约20个不同蛋白组成的多蛋白复合体[17-19]，在从酵母到人类的所有真核生物中，调节器的作用是将正负信号从与DNA结合的特异基因转录因子传递给RNA聚合酶II及其通用转录因子（图2），其中图2物质包含DNA、通用转录因子TBP，TFIIB，E，F和H、调节器、RNA聚合酶以及与增强子结合的特异性转录因子。在探索转录过程研究中调节器的发现是一个里程碑。
随着调节器被分离，真核基因调节和转录的基本组分已被建立，即通用转录因子、调节器和RNA聚合酶II。细菌中的转录抑制和激活是其直接与RNA聚合酶结合，从而影响与启动子的结合。真核中染色质和调节器在基因特异性转录因子与RNA聚合酶之间起作用，使得调节更加复杂化。
Asturias等在1999年[20]得到了RNA聚合酶II-调节器复合物的电镜图，此图显示调节器围绕聚合酶成月牙形。调节器包含大约20多肽，1MDa。近来有关功能的调节器头部分子的表达和纯化已有报道。此复合物只有7个亚基，分子量为223kDa[21]。调节器头部分子与RNA聚合酶的相互作用需要通用转录因子TFIIF的参与。
3.2.2 酵母RNA聚合酶及转录复合物结构描述
早在10年前，X-射线结晶学已描述了TBP结合于TATA-box DNA，以及TFIIB，TBP和DNA三重复合物的结构[22-25]。Kornberg则首先意识到所有真核转录元件的组装可能是以RNA聚合酶作为一个平台，但是酵母RNA聚合酶II的复杂性以及纯化复合物的少量和不稳定性成为晶体研究的瓶颈。Kornberg用电镜和X-射线结晶学相结合，依据自己20年来对蛋白表达纯化的研究经验和二维蛋白结晶的方法最终解决了这个问题[26]。

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