PCR程序中60度1个小时是什么作用,好像是补A不全。

2025-02-25 21:41:13

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回答1：

你们的扩增太变态了！
我感觉60度60分钟不是加A而是让你的繁多的目的片段充分、特异性的退火，不至于结合到其他的链上去。你这个反应有时产物之间会形成非特异性退火，只有长时间、合适温度孵育才能退火充分。否则电泳时会形成预期条带之外的片段。你说的双肩峰不是很明白。
另外Taq酶加A的功能是因为具有微弱的末端转移酶活性，产物3‘突出一个A，而加出来的A是不会与引物配对的，所以不会越扩越长。查查文献或画个图就明白了。

回答2：

你们是做TA克隆的吧
PCR程序中60度1个小时就是补A不全
做TA克隆的时候，片段用taq酶扩增，因为taq酶在片段的末尾会加上一个A，而T载体就是有T粘性末端的载体，可以与有A的片段互补，最后连接上。
而taq的保真性不高，有方法是先用高保真酶进行pcr然后加上taq酶补A，使得片段末端都加上A，有利于片段克隆到T载体上。