最可能你的cDNA内部含有酶切位点，建议仔细检查，这种可能性最大。另外楼上说的内切酶Star活性也是有可能的。
另外，如果检查上面的问题没错之后，建议把退火温度降低到52度试试。
另外加接头以后，有可能出现非特异性互补，造成引物错配，建议用加上接头的序列进行引物互补分析。
从你的电泳结果看，酶切并连接接头后，管家基因的扩增片段变小了，并且有些呈现弥散状。
你考虑下是否是内切酶具有星活性造成管家基因的cDNA被切割。
应该是没有影响吧~你的这个退火温度是不是有点高啊~
唉，我这几年生物学的~帮不上你什么忙啊~
检查一下引物，重新算一下它的退火温度，因为某些生物合成公司的温度计算有出入，建议跑个梯度PCR（50-60度）
你做的是什么啊？抑制消减杂交？
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