采用组织分离法培育菌种要经过哪些步骤？

蘑菇、香菇、平菇、金针菇、猴头菇、竹荪等栽培食用菌，以及松乳菇、松茸等纯化中的食用菌，均可采用组织分离法获得菌种。现以香菇为例说明组织分离法的主要步骤。
（1）选择种菇按上述标准挑选种菇，采收后装入无菌纸袋内（忌用塑料袋）。（2）组织分离在无菌条件下，先用酒精棉球对菇体进行表面消毒，然后手持菌柄，将香菇撕成两半，取手术刀经火焰灭菌、冷却后，在菌盖、菌柄交界处或菌柄的上部挑取一小块（米粒般大小）菌肉，移植到PDA斜面上（事先配制并灭菌备用），即可转入培养观察阶段。（3）培养观察上述组织分离物在25℃条件下，经过3～5天即可看到分离物表面长出白色绒毛状菌丝，呈星芒状在培养基上生长。培养期间，应每隔1～2天检查1次，随时淘汰霉菌或细菌污染的培养物。培养10～15天后，再作1次转管培养，即可得到香菇母种。然后经栽培试验，确认其可以正常出菇后方可用于菌种生产和栽培。

菌棒分离法，包括耳（菇）木分离法和代料基质分离法，通常称之为“基内菌丝分离法”。菌棒分离法是获得胶质菌的常用方法。菌棒分离法的主要步骤如下：

（1）耳木分离法

耳木的采集，必须在木耳、银耳出耳盛期，在已经长过子实体的耳木上，选择菌丝生长旺盛，周围无杂菌的部分，用锯截取一小段，先把耳木表面的杂物洗净，然后风干或充分晾干，使耳木干燥。在分离之前，先把耳木通过酒精灯火焰，重复燎过多次，烧去表面的杂菌孢子，再用75%酒精表面消毒。组织块必须从耳木中菌丝蔓延生长的部位选取，用无菌解剖刀挑取一小块耳木组织，接入PDA培养基上，挑取的组织块越小越好，可减少杂菌污染，提高分离成功率。培养基高压灭菌后加入广谱抗菌素（每毫升培养基加链霉素或青霉素50～100单位），抑制细菌生长。认真检查组织分离获得的菌丝体，淘汰杂菌。挑取菌落边缘菌丝，接种到新的培养基上，获得纯培养。

（2）代料基质分离法

选择子实体发生早、产量高、无病虫害的栽培瓶或栽培袋，待子实体长至八成熟时，从中筛选出最佳的一瓶（或袋），去掉子实体，然后用75%的酒精消毒整个栽培瓶（或袋），同时将接种工具和待接培养料一起放入接种箱内，用甲醛熏蒸消毒。分离时，去掉料面老菌丝，用接种针挑取小块长有菌丝的培养料，接入试管内，适宜温度下培养。选取菌丝生长良好的试管转管纯化。