1、查找该物种或近缘物种信息，看是否能确定内含子序列的位置，在CDS上设计跨内含子的引物，以避免基因组污染；2、扩增片段大小最好在200bp左右，太大会影响扩增效率；3、最好一次分别设计两条上游（距离较近）和下游引物（距离较近），组合成4个扩增片段；4、用任何方法或软件设计好的引用都要用少量cDNA样本来验证引物扩增效果：主要是有无二聚体？有无非特异性扩增？5、筛选出一对最满意的引物上机，祝你实验顺利。
